¿Esferoides, organoides?
Cultivos celulares en dos y tres dimensiones, usos y aplicaciones.

Tema: Se presenta definición, origen e importancia de los cultivos de células animales, así como los tipos de acuerdo con sus preferencias de adherencia y estructura dimensional, haciendo énfasis en sus aplicaciones e importancia en el desarrollo de la ciencia, particularmente en los campos de la biomedicina y la biotecnología.

1. Introducción

1.1 ¿Qué son los cultivos celulares? 

Los cultivos celulares son una serie de técnicas de laboratorio de uso común, donde las células se cultivan en condiciones controladas (in vitro), normalmente fuera de su entorno natural (ELGA VEOLIA, 2024). El cultivo in vitro proporciona un ambiente controlado para estudiar el comportamiento celular. Los cultivos se utilizan para estudiar el desarrollo y la diferenciación de las células, como modelos experimentales en investigación básica, medicina, aplicaciones farmacéuticas, y para fabricar proteínas terapéuticas, vacunas y anticuerpos monoclonales (Merck, 2024a).

Los cultivos celulares son un elemento importante en la biología celular y molecular, así como en la industria farmacéutica, ya que son muy útiles para estudiar algunas enfermedades, el efecto y/o eficiencia de los fármacos y compuestos tóxicos en las células. Como se muestra en la figura 1, el inicio del desarrollo de estas técnicas se dio en 1866, cuando Von Recklinhausen (patólogo alemán) pudo mantener vivas células sanguíneas de anfibios durante 35 días. El avance de las nuevas tecnologías de cultivo celular, que respaldan el crecimiento de las células de mamíferos más relevantes como modelos de estudio (las células primarias, las células madre, el cultivo celular en 3D -esferoides- y los organoides), ha ayudado a mejorar la validez de las conclusiones científicas y a promover una salud humana mucho más avanzada y menos agresiva (Merck, 2024a).

Figura 1. Grandes hitos en el desarrollo de las técnicas del cultivo de células animales (Brito, 2024)

1.2 ¿Cuáles son las principales técnicas para cultivos celulares de vertebrados?

Los dos enfoques más destacados del cultivo de células de mamífero son el cultivo primario y el cultivo continuo. Los cultivos primarios proceden directamente de los tejidos humanos o animales, y su esperanza de vida (en cultivo) depende del envejecimiento celular (hasta 50 días). Los cultivos continuos se consideran «inmortales», ya que generalmente derivan de tejidos cancerosos. Las líneas celulares también pueden crearse inmortalizando las células y pueden propagarse en serie o pasadas (subcultivos) durante numerosos ciclos de división celular o indefinidamente (Merck, 2024c).

Las células pueden crecer en suspensión o de manera adherente. Algunas células viven de forma natural sin adherirse a una superficie, como las que existen en la sangre. Otras necesitan una superficie, como la mayoría de las células derivadas de tejidos sólidos. A las células que se crecen sin unirse a una superficie se les llama cultivos en suspensión (Figs. 2-1 y 2-2). Algunos cultivos celulares adherentes (Figs. 2-3 y 2-4) pueden crecer en plástico, que puede estar recubierto con componentes de la membrana celular para aumentar sus propiedades de adhesión y proporcionar algunas señales (químicas) necesarias para el crecimiento y diferenciación (Wikipedia, 2024).

Figura 2. Principales tipos de propagación (cultivo) de células animales. 1, Biorreactor escala laboratorio de investigación; 2, vista mediante microscopía óptica, de una muestra de un cultivo de células en suspensión; 3, cultivo de células adherentes en botellas del cultivo; 4, vista, mediante microscopía óptica, de una un cultivo adherente -fibroblastos-) (Canva).

1.2 ¿Para qué se usan las células cultivadas?

Las células cultivadas se utilizan como modelos simples (de biología compleja) en investigación, genética, biológica, biomédica y biotecnológica, además, de para la fabricación de productos biológicos como vacunas, proteínas y anticuerpos terapéuticos y productos de citoterapia (Merck, 2024c). Conforme aumenta la necesidad de tratamientos biológicos y vacunas, va aumentando el interés por establecer procesos de cultivo celular más eficientes mediante el desarrollo de:

• Líneas y cultivos celulares para un mayor rendimiento

• Medios de cultivo celular optimizados para expansión y producción

• Biorreactores que potencien el crecimiento y la escalabilidad celulares, para

2. ¿Cuáles son los principales tipos de cultivos celulares y en qué se diferencian?

En general, se distinguen cinco tipos de cultivo celular de acuerdo con su estructura y uso (EHU. 2024; Merck, 2024d):

2.1 Cultivo de órganos. Se coloca el órgano sobre una rejilla situada en la interfaz líquido-gas de un medio del que obtiene los nutrientes y al que puede liberar los desechos. Este tipo de cultivo permite mantener, al menos en parte, la arquitectura característica del tejido “in vivo” (Fig. 3-1). 

2.2 Explantes primarios. Se coloca un fragmento de tejido o de órgano en la interfaz sólido-líquido de un soporte de vidrio o de plástico. Las células se adhieren a la superficie y las células de la periferia del explante pueden migrar y proliferar por la superficie del soporte (Fig. 3-2).

2.3 Cultivo celular primario. Es el tipo de cultivo más utilizado, se puede obtener a partir de explantes primarios o de suspensiones de células disgregadas. La disgregación celular se realiza por métodos enzimáticos o mecánicos. En estos cultivos se pierden las interacciones célula-célula y las interacciones de la célula con la matriz extracelular. Sin embargo, las células son capaces de proliferar y la población celular crece notablemente hasta cubrir toda la superficie de cultivo (Fig. 3-2).

1. Cultivos en suspensión: las células se encuentran dispersas en el medio de cultivo (Figs. 2-1, 2-2, 3-3).

2. Cultivos en monocapa: las células crecen adheridas sobre un soporte sólido (plástico o vidrio), este tipo de cultivo siempre se ha considerado en dos dimensiones, es decir, en monocapas de células adheridas a una superficie de crecimiento. Sin embargo, este tipo de cultivos (2D) no reflejan la realidad in vivo (Fig. 2-3, 2-4, 3-2).

2.4 Cultivos histotípicos y organotípicos. El objetivo final de este tipo de cultivos es la creación “in vitro” de tejidos u órganos completamente funcionales que puedan ser utilizados en injertos o en trasplantes. Los cultivos organotípicos constituyen la base de una nueva disciplina denominada ingeniería de tejidos (Fig. 3-4).

1. Los cultivos histotípicos: son cultivos de un solo tipo celular que consigue alcanzar una elevada densidad celular (tal y como ocurre en los tejidos).

2. Los cultivos organotípicos: constan de varios tipos celulares que interaccionan entre sí de una forma que intenta parecerse lo más posible a la original.

Figura 3. Clasificación de cuatro de los principales tipos de cultivos de acuerdo con su estructura (Modificado de EHU, 2024).

2.5 Cultivos celulares en tres dimensiones (3D). Como ya sabemos, el cultivo celular tradicional se desarrolló en superficies bidimensionales (2D) simples y no porosas, lo que facilitó la expansión de esta técnica vital en las ciencias de la vida. Sin embargo, en la vida real las células interactúan con su entorno en tres dimensiones, por lo que las herramientas, los reactivos y las técnicas de cultivo celular tridimensional han contribuido a generar modelos celulares in vitro más predictivos para diversas aplicaciones y disciplinas (investigación del cáncer, cribado de fármacos, neurociencia y medicina regenerativa, entre muchas otras) (Fig. 4). 

Figura 4. Esquemas representativos de cultivos en dos (2D) y tres dimensiones (3D) (Modificado de Sole Medina, 2018).

3. ¿Cuáles son los principales tipos de cultivos de células en 3D?

En términos generales, los modelos de cultivo celular en 3D pueden clasificarse en tres categorías principales, en función del método de generación (Fig. 5):

3.1 Métodos con armazones en los que se utilizan hidrogeles o andamios estructurales.

• Hidrogel. Las células incluidas en hidrogeles tridimensionales pueden polarizarse, diferenciarse y tener atributos funcionales que se asemejan mucho a los tejidos fisiológicos. Las líneas celulares inmortalizadas tradicionales pueden cultivarse incluidas en hidrogeles para formar complejos multicelulares denominados esferoides. Se ha demostrado que los esferoides proporcionan una gran cantidad de información que no se observa en las mismas células cultivadas en condiciones bidimensionales (Fig. 5A).

• Andamios estructurales. Son herramientas que facilitan el crecimiento de las células en un entorno tridimensional (Fig. 5B). Un enfoque bien establecido para el cultivo celular en 3D consiste en cultivar células en armazones estructurales, normalmente compuestos de biopolímeros dispuestos de tal modo que imiten la matriz extracelular fisiológica (ECM, por su acrónimo en inglés). Existen diferentes tipos de andamios, entre los que se pueden mencionar: los de nanofibras, de colágeno, de poliestireno y de policaprolactona, entre otros (Merck, 2024).

Figura 5. Ejemplos de herramientas para cultivo de tejidos 3D. A, Uso de hidrogeles; B, Uso de andamios estructurales; C, generación de organoides (Tomado de Merck, 2024d).

3.2 Enfoques sin armazones.

En este tipo de enfoque se parte de cultivos no adherentes o en suspensión, que promueven la agregación de las células que forman estructuras conocidas como esferoides (Fig. 5B).

• Esferoides. Para el desarrollo de esferoides, se aprovecha la tendencia natural a agregarse que muestran muchos tipos celulares que son objeto de cultivo in vitro (Fig. 6). En la práctica, este modelo puede usarse en cualquier tipo de investigación biomédica, debido a que, si se dan las condiciones adecuadas, se pueden formar esferoides con cualquier tipo de célula. Entre los métodos mas sencillos para generar esferoides se puede mencionar el método de la gota colgante (Fig. 6) que consiste en crear gotas de una suspensión celular sobre la cara inferior de una superficie de vidrio o plástico (placa de Petri) o utilizando placas de 96 pocillos de fondo horadado (Fig. 6), o usando un agente compactante (Fig. 7, p. ej. una emulsión de aceite-surfactante).

Figura 6. Generación de esferoides in vitro, usando la técnica de la gota colgante. A) Izq. Esferoides en la cara inferior de un vidrio circular y Der. en placa de 96 pocillos de fondo horadado. B) Esquema del desplazamiento celular durante la formación de un esferoide en el interior de una gota colgante. C) Micrografías de fibroblastos de ratón L929, cultivados para la formación de esferoides, en donde se muestran los cambios en la distribución de las células conforme aumentan los días del cultivo (Elaborado a partir de Meseguer et al., 2016 -A y B- y Juárez-Moreno, 2020 -C-).

Figura 7. Formación de esferoides multicelulares dentro de gotitas de medio/emulsión (M/O, por sus siglas en ingés). A y B) Diagramas esquemáticos que muestran el principio de formación de un esferoide multicelular (A vista lateral, B vista superior). C) Vista superior de una secuencia representativa de imágenes de campo claro (de lapso) durante la formación de un esferoide en una gota de 100 μL M/O (barras 300 µm) (Tomado de McMillan et al., 2016).

• Métodos en los que se promueve la diferenciación de las células. Los organoides son colecciones complejas de células cultivadas en un medio de cultivo tridimensional que rememoran muchas de las características fisiológicas y genómicas de varios tejidos u órganos (Fig. 5C). Los organoides proceden de células madre embrionarias (ESC, por su acrónimo en inglés), células madre pluripotentes inducidas (iPSC, por su acrónimo en inglés) o células madre adultas (ASC, por su acrónimo en inglés) y se diferencian a través de una serie de señales controlables en un conjunto diverso de tipos celulares semejantes a los que se encuentran en sus respectivos tejidos fisiológicos (Fig. 8). Al inicio, uno de los campos de investigación fue la creación de organoides que reprodujeran los epitelios intestinales, pero actualmente la técnica se ha expandido a otros órganos siendo una de las áreas más interesantes los organoides cerebrales.

Existen dos principales formas de fabricarlos:

1. Técnicas no guiadas: parten de células madre humanas (pluripotenciales) que se cultivan in vitro limitando al máximo el uso de señales bioquímicas externas que dirijan el crecimiento. Esto da lugar a una gran variabilidad que en algunos casos deriva en la formación de organoides con una composición celular bastante similar al del órgano blanco.

2. Técnicas guiadas: se parte de la misma base, pero hay una mayor intervención en el desarrollo del organoide mediante el uso de biomoléculas. Esto tiene como resultado que se pueden producir organoides mucho más específicos, los cuales tienen composiciones celulares que mimetizan la de partes concretas del órgano blanco en desarrollo (Tabla 1).

Tabla 1. Factores de inducción, diferenciación y maduración usados para la generación de organoides (Amiel-Perez et al., 2022; Gerli et al., 2024).

4. ¿Cuales son las ventajas y desventajas de los cultivos en 2 y 3 dimensiones?

Tradicionalmente, los cultivos celulares únicamente se habían clasificado como en placa o en suspensión. Esto, a propósito de la necesidad de adherencia de las células a un sustrato para su supervivencia y multiplicación. En cuanto al cultivo de células adherentes (en placa), siempre se ha considerado en dos dimensiones, es decir, monocapas de células adheridas a una superficie de crecimiento. Sin embargo, los cultivos 2D no reflejan la realidad in vivo, ya que en realidad las células se distribuyen de forma más compleja, forman tejidos y órganos, es decir, crecen y de distribuyen en microambientes tridimensionales (3D) en los que la entrada de nutrientes y salida de desechos es continua.

Los cultivos en 3D son más heterogéneos, y como ya hemos visto, se han desarrollado diferentes tipos: como la agregación, el cultivo en esferas, los cultivos en hidrogel, los biorreactores rotantes con agregados celulares o microacarreadores o los cultivos organotípicos. Cada tipo de cultivo es diferente en términos de dispersión celular y capacidad de preservar la función del tejido. Por eso, las técnicas de cultivo celular en 3D surgen como una necesidad para tratar de reflejar con mayor fidelidad lo que está ocurriendo in vivo y asi obtener resultados que lo simulen más fielmente. Las células se comportan estructural y funcionalmente de forma diferente cuando crecen en un substrato 2D que cuando están sembradas en una capa gruesa de moléculas poliméricas, los cultivos en 3D muestran mayor grado de complejidad y de homeostasis estructural, emulando lo que ocurre en tejidos y órganos. En la tabla 2, se confrontan las ventajas y desventajas de cutivo de tejidos en 2D comparado con los 3D. 

Tabla 2. Ventajas y limitaciones de los cultivos celulares con base en su estructura: 2D y 3D (Tomado de Sole Medina, 2018).

5. Conclusiones

Siendo realistas y aunque la mayor limitación de los cultivos 3D es la distribución de los nutrientes y su observación (Fig. 8). En esta figura, se muestra a homogeneidad celular de un esferoide (Fig. 8A), y las limitantes señaladas en la fotografía al describir su estructura. Sin embargo, y lo que diferencia a los esferoides de los organoides, es que en los organoides hay una diferenciación celular en capas, lo que asemeja un órgano (en el contexto mas simple) y, por tanto, gran parte de su funcionalidad (Fig. 8B). Es obvio que este tipo de cultivos es un paso clave para un mejor y mas rápido avance en el estudio y desarrollo de nuevas moléculas para hacer frente a retos tan complejos como la enfermedad Alzheimer y el Trastorno del Espectro Autista, que son los retos clave en relación con los padecimientos de las nuevas generaciones, y otras como la diabetes que aun no hemos podido entender y tratar al 100% dada sus naturalezas multifactoriales.

Figura 8. Comparación entre un esferoide y un organoide. A) Estructura interna de un esferoide tumoral (Tomado de Aleman Miranda y Valenzuela Reyes, 2017), B) Mini Riñón de 1 mm generado a partir de células madre de un paciente (Tomado de Diario Médico, 2017).

6. Referencias

Alemán Miranda L.L., Valenzuela Reyes M.B. 2017. Comparación del crecimiento y morfología de esferoides tumorales obtenidos por agitación mecánica. Tesis para obtener el titulo de Ingeniero Biomédico. Universidad Autónoma de Ciudad Juárez. Instituto De Ingeniería y Tecnología, Departamento de Ingeniería Eléctrica y Computación. 141p.

Brito, L. 2024. Aspectos básicos sobre el manejo y preservación de los cultivos celulares. Instituto Nacional de Higiene Rafael Rangel. https://www3.paho.org/hq/dmdocuments/2010/L%20Brito%20INHRR.pdf. Consultado 09/04/2024. Consultado 01/04/2024.

Diario Médico. 2017. Los organoides alcanzan la madurez como modelos de enfermedades. Actualizado 13/02/2018. Consultado 30/04/2024.

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McMillan K.S., McCluskey A.G., Sorensen A., Boyd M., Zagnoni M. 2016. Emulsion technologies for multicellular tumour spheroid radiation assays. Analyst., 141(1):100-110. https://doi.org/10.1039/c5an01382h

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Wikipedia 2024. Cultivos celulares. https://es.wikipedia.org/wiki/Cultivo_celular.