Desde la agricultura hasta probióticos: aplicaciones Biotecnológicas de Bacillus spp.

Tema: El género Bacillus está representado por bacterias sumamente versátiles que pueden crecer en diferentes ambientes y condiciones extremas. Estas bacterias tienen la capacidad de producir una gran variedad de metabolitos no tóxicos ni dañinos al medio ambiente. Sus efectos beneficiosos se reflejan en diferentes áreas, como en la producción de probióticos para alimentos, como promotores del crecimiento vegetal en la agricultura, y como biofungícidas en la industria, donde también destacan por la producción de enzimas, entre otros usos. A continuación, presentamos una descripción general del uso de este género en diferentes campos y la aplicación de sus diferentes especies.

Agricultura, fertilizantes, agroquímicos y BPCV.

Las actividades agrícolas tienen como objetivo suministrar los alimentos necesarios a la población y proveer ingresos al agricultor. Para lograrlo se requiere aumentar y mejorar la producción de los cultivos, que hasta el momento se ha logrado con el empleo de fertilizantes químicos, ya que con ellos los rendimientos en los cultivos se llegan a duplicar o triplicar. Esta eficiencia ha incrementado su uso, sin embargo, su empleo desmedido y la falta de regulación han puesto en riesgo la inocuidad del agua, suelo y aire por el exceso de minerales introducidos y pérdida de nutrientes en el ambiente (FAO, 2014) así como la acumulación de residuos orgánicos en cuerpos de agua (eutrofización).

Aunado al uso de fertilizantes químicos, el empleo de plaguicidas (ej. herbicidas, insecticidas, acaricidas, etc.) con la finalidad de eliminar insectos, plantas, hongos y otros organismos no deseados en los cultivos han contribuido también a la contaminación de suelos, aire y agua. El uso excesivo de fertilizantes y agroquímicos en general no sólo afecta el medio ambiente, también repercute en la salud humana al ser altamente tóxicos debido a su composición y estructura química, causando efectos agudos y crónicos en el ser humano, como esterilidad, anemia, cáncer, alteraciones del sistema inmune, entre otros (SEGOB, 2023). Esto ha llevado a buscar alternativas para producir fertilizantes inocuos al medio ambiente, obtener cultivos con igual o mayor rendimiento que garanticen la seguridad alimentaria sin efectos adversos en los humanos (Daniel et al., 2022) y la Biotecnología ha permitido buscar alternativas de proveer a las plantas de los nutrientes necesarios sin poner en riesgo el ambiente y la salud humana.

Entre estas alternativas, está el empleo de microorganismos como bacterias promotoras del crecimiento vegetal (BPCV) precisamente para promover el crecimiento de plantas, pero además, microorganismos para el control biológico de patógenos causantes de enfermedades en cultivos agrícolas. El empleo de BPCV contribuye al desarrollo de prácticas agrícolas sostenibles, que garantizan la seguridad alimentaria y la salud del medio ambiente por la disminución de los efectos asociados al uso de insumos sintéticos (Saeed et al., 2021, Chukwudi Timothy et al., 2020, Syed Ab Rahman et al., 2018).

Varios estudios han demostrado el uso de diferentes especies de bacterias como agentes de control biológico, como es el caso de Azospirillum, Agrobacterium, Pseudomonas, Azotobacter (Felker et al. 2005, Romero-Perdomo et al. 2017), y un grupo importante que se ha empleado como BPCV es el genero Bacillus. Desde los años cuarenta, Bacillus spp. ha sido utilizado en la agricultura principalmente como biofertilizante, bioestimulante o biofungicida (Nordgaard et al., 2022), debido a sus estrategias adaptativas como la formación de biofilm y la producción de metabolitos secundarios como fitohormonas que promueven el crecimiento vegetal, y quitinasas que inhiben el crecimiento de hongos fitopatógenos, (Feng et al., 2022 Pedraza et al., 2020, Hashem et al., 2019, Vejan et al., 2016).

Bacillus spp.

El género Bacillus está compuesto por más de 300 especies filogenética y fenotípicamente heterogéneas (morfología celular distinta) las cuales se encuentran distribuidas a nivel mundial gracias a su capacidad de producir esporas que se diseminan con el aire. De acuerdo con Harirchi et al. (2022) y Villarreal-Delgado et al. (2017), este género se divide en cuatro grupos principales. El grupo (A) de B. cereus que está asociado a patogenicidad debido a que incluye especies que tienen la capacidad de producir enterotoxinas causantes de intoxicación alimentaria en el ser humano como B. anthracis y B. thuringiensis. Grupo (B) se encuentra constituido por B. subtillis, B. licheniformis y B. pumilus, bacilos ambientales presentes en diferentes hábitats y caracterizados por su aplicación biotecnológica. Grupo (C) tiene a las especies B. clausii-halodurans, y grupo (D) con las especies Bacillus sp. NRRLB-14911-coahuilensis (Barros-Rodríguez et al., 2020, Villarreal-Delgado et al., 2017).

Morfología y caracterización de Bacillus spp.

Las especies del género Bacillus se caracterizan por ser células bacilares Gram positivas. Sus colonias pueden ser variables, desde elevadas hasta convexas, pequeñas o grandes, circulares a irregulares y de textura suave a rugosa (Harirchi et al., 2022). Casi todas las especies pueden moverse mediante flagelos perítricos y son capaces de producir esporas resistentes a la desecación y a otras condiciones ambientales extremas, por lo que sobreviven en ambientes hostiles. Su crecimiento es aerobio y en algunos casos anaerobio facultativo, crece sin ninguna dificultad en agar nutritivo y en agar soya tripticaseina (Ramirez-Olea, 2022, Harirchi et al., 2022).

Los métodos de identificación de estas especies van desde observar su morfología al microscopio con tinción de Gram, dónde se deben observar bacilos de color azul oscuro o violeta (Gram positivos), hasta diversas pruebas bioquímicas y moleculares. Algunos bacilos producen hemolisinas, proteínas que causan permeabilidad en la membrana de otras células como mecanismo de acción para competir por espacio, esto se puede evaluar sembrando a la bacteria en agar sangre al 5% dónde a las 24 horas se observarán colonias de color gris a verde, con bordes ondulados que indican la lisis parcial de los eritrocitos (hemólisis beta) (Figura 1A). Las cepas de Bacillus también son formadoras de biopelículas o biofilm, una comunidad bacteriana incorporada en una matriz de exopolisacáridos que le permite adherirse a una superficie, esto puede analizarse mediante métodos cualitativos utilizando colorantes como safranina, azul de metileno o cristal violeta que tiñen las superficies donde se formó la biopelícula (Figura 1B) (Bulgari et al., 2022, Celandroni et al., 2016). La capacidad de desplazarse en búsqueda de nutrientes y mejores condiciones para habitar lo realiza por flagelos perítricos, para identificar esta habilidad se crece la bacteria en agar semi sólido a diferentes concentraciones de agar, lo que permite observar si la bacteria puede nadar y desplazarse sola o en grupo con las demás bacterias (Figura 1C), esto será visible según el tipo de crecimiento que se observe en el medio (Celandroni et al., 2016). Un método de identificación rápido y preciso para todo tipo de bacterias es la amplificación del gen que codifica para el ARNr 16S, un gen altamente conservado en diferentes especies bacterianas, y mediante la secuenciación del gen permite establecer y determinar las relaciones filogenéticas de la bacteria. Y para identificar si las cepas de Bacillus son capaces de producir toxinas, se hace a través de la amplificación de los genes nheABC y cytK, que codifican para la entorotoxina y Citotoxina K respectivamente (Figura 1D).

Figura 1. Pruebas para caracterizar bacillus spp.

A. Detección de hemolisinas. 

El Bacillus spp. a probar se siembra en un medio solido suplementado con sangre al 5% se incuba a 370C por 24hrs. Si el crecimiento bacteriano muestra coloración opaca o verdosa y si presenta un halo claro brillante alrededor de la colonia (línea punteada) la cepa es β-hemolitica, el color de la colonia indica lísis de eritrocitos y el halo blanco ausencia de estos en el medio.

B. Formación de biofilm. 

Se inocula 1mL de caldo nutritivo con 100uL de bacillus spp. y se incuba por 24hrs a 370C, la formación de biofilm se revela utilizando el reactivo cristal violeta que se une a la pared celular de la bacteria. Si la bacteria no forma biofilm, no se unirá a la superficie (B. Control -). Si la bacteria no presenta flagelo y forma biofilm, este se formará en el fondo del tubo (B. Bacillus spp. flecha negra abajo), si la bacteria tiene uno o más flagelos, el biofilm se forma en las paredes o en la parte superior del tubo en forma de anillo (B. Bacillus spp. flecha negra arriba).

C. Motilidad

La bacteria se crece en agar semi sólido a diferentes concentraciones de agar. Según el tipo de crecimiento que se observe se determina la movilidad de la bacteria. En C se observa 3 cepas de Bacillus con diferentes capacidades de movilidad. (C1) poco móvil, (C2) medianamente móvil, (C3) muy movil.

D. Detección de genes que codifican para toxinas en Bacillus spp.

Amplificación por medio de PCR de una región de los genes nheABD y cytK que codifican para la enterotoxina no hemolítica (NHE) y citotoxina K respectivamente, causantes del síndrome emético y el síndrome diarreico en humanos. Los productos de PCR se separan por tamaño mediante una electroforesis en un gel de agarosa y se visualizan utilizando un agente que se intercala en el ADN y es excitado con luz UV (MW: Marcador de peso molecular, pb: pares de bases).

Fotos: 1A, B y D datos no publicados, Flor Avila Rebolledo, C proporcionada por Yanet Romero Ramírez.

Usos y aplicaciones de Bacillus spp.

En la Biotecnología

La mayoría de las especies del genero Bacillus son reconocidas por ser seguras, no tóxicas y no patogénicas, aparte de tener altas tasas de crecimiento, densidad celular y resistencia a ambientes hostiles. Produce una gran variedad de enzimas y metabolitos a los que se les ha encontrado diversas aplicaciones en el campo de la Biotecnología. Por ejemplo, las enzimas producidas por diferentes especies de Bacillus tienen la capacidad de degradar diferentes compuestos como lípidos, polisacáridos, proteínas, hidrocarburos y otras sustancias. Además, muchas de estas enzimas son termorresistentes, se mantienen estables y funcionales a altas temperaturas, por ejemplo, la α- amilasa producida por B. licheniformis es termoestable en un rango de temperatura de 50 a 100 °C, otras enzimas son capaces de funcionar a diferentes rangos de pH (Muras et al., 2021).

En la agricultura

El uso de Bacillus spp. como BPCV o biofungicidas en cultivos, proporciona principalmente nutrientes a la planta, pero además, protección a la planta contra condiciones ambientales adversas o a diferentes tipos de estrés como: sequía, salinidad, presencia de metales pesados, parásitos, patógenos como hongos o bacterias. Especies como B. pumilus, B. subtilis, B. megaterium, Bacillus licheniformis entre otras ayudan al crecimiento de la planta, aumentan la cantidad de agua en la planta así como nutrientes, pigmentos y hormonas (Radhakrishnan et al., 2017, Bolaños-Dircio et al., 2021).

Como probiótico

Los probióticos son alimentos y/o suplementos que contienen microorganismos vivos no patógenos, que colonizan y mantienen el microbiota normal (bacterias "buenas") del intestino mejorando la salud del huésped (Bodke et al., 2022). Las células y esporas de diferentes especies del género Bacillus, se han empleado ampliamente como probióticos comerciales en diferentes áreas como la salud humana, aplicaciones veterinarias y en la acuicultura como alimentos y suplementos que proveen nutrientes y producen enzimas digestivas que ayudan al organismo (Harirchi et al., 2022, Muras et al., 2021, Kuebutornye et al., 2019).

En la industria alimentaria, B. subtillis se ha utilizado como probiótico desde 1986, esta bacteria puede transformar la D-fructosa en D-alulosa, un compuesto utilizado para sustituir la sacarosa, lo cual ayuda a la disminución de carbohidratos en el procesamiento de los alimentos, también se ha empleado como aditivo para pollos de engorda. En la ganadería, este género promueve el crecimiento, facilita y estimula el apetito e incrementa la absorción de nutrientes.

En la acuicultura, una de las medidas para prevenir enfermedades en cultivos de peces es la suplementación con probióticos en la dieta para estimular el sistema inmune, aparte de promover el crecimiento de los organismos acuáticos. Los probióticos pueden modular la inmunidad innata y la respuesta inmune humoral mediante la regulación de la expresión de genes relacionados con el sistema inmunológico (Kuebutornye, 2019). Muchas veces B. subtillis se administra en consorcio(s) con otras especies del mismo género como B. coagulans, B. subtilis, B. indicus, B. clausii, B. licheniformis, entre otros (Muras et al., 2021).

En la salud humana.

Aparte de su función inomoduladora, diversas especies de Bacillus (ej. B. subtillis, B. thuringiensis, B. licheniformis) poseen actividad antioxidante, producen compuestos antimicrobianos y moléculas efectoras extracelulares capaces de interactuar con los mecanismos de defensa del huésped mediante adhesión a bacterias potencialmente patógenas. Estas propiedades le permiten equilibrar la microbiota intestinal, mejorar la permeabilidad intestinal y aumentar el efecto bactericida de los ácidos biliares, lo que también favorece el crecimiento de la microbiota y ayuda a recuperar la mucosa intestinal de lesiones generadas por enfermedades (He et al., 2023, Muras et al., 2021).

Además, Bacillus spp. tiene la habilidad de inhibir patógenos a partir de la producción de antibióticos, bacteriocinas y enzimas líticas, capaces de inhibir gran variedad de bacterias como el estreptococo (Streptococcus) causante de enfermedades como la faringitis, neumonía, o infecciones en la piel y heridas (Harirchi et al., 2022, Muras et al., 2021). Otro ejemplo, es el empleo de estas enzimas en quimioterapia como la L-asparaginasa, una enzima con mayores ventajas que las comerciales que se utiliza para el tratamiento de la leucemia. Por otra parte, la industria farmacéutica ha tomado gran interés en especies como B. licheniformis, B. subtillis, B. pumilus, por su capacidad de producir compuestos activos que van desde agentes antivirales y antitumorales hasta péptidos antimicrobianos y bacteriocinas como la tirocidina, bacitracina, y polimixina entre otras (He et al., 2023,  Harirchi et al., 2022, Muras et al., 2021).

Infección en humanos e intoxicación alimentaria.

Sin embrago, hay algunas especies de Bacillus de importancia clínica por ser causantes de intoxicaciones y enfermedades en humanos y animales, tal es el caso de B. cereus que ocasiona el síndrome emético por la producción de la toxina emética y el síndrome diarreico el cual es causado por las enterotoxinas como la hemolisina BL (HBL), enterotoxina no hemolítica (NHE) y citotoxina K (Ehling-Schulz et al., 2019, Boer, 1993). Esta bacteria está presente en carnes, huevos y en algunos productos lácteos, ya que debido a sus esporas puede tolerar los procesos normales de cocción e incluso resistir las condiciones ácidas del estómago. En esta misma línea, el potencial patogénico y de virulencia de B. anthracis se debe a que contiene dos plásmidos como parte de su genoma, pXO1 y pXO2. El plásmido pXO2 codifica para los genes de la cápsula, la cual le permiten evitar la fagocitosis por parte de células del sistema inmune del hospedero. Los genes contenidos en el plásmido pXO1 codifican para el complejo de toxinas; antígeno protector (AP), factor del edema (FE) y factor letal (FL), las cuáles no son infecciosas individualmente, pero al conjugarse causan daño según la vía de infección, cutánea, intestinal o respiratoria (Ehling-Schulz et al., 2018, Harirchi et al., 2022) (Figura 2).

Figura 2. Especies de Bacillus causantes de infecciones y enfermedades.

Bacillus anthracis es el bacilo mejor conocido por producir la enfermedad del ántrax, seguido por B. cereus que causa intoxicación en humanos por consumir comida contaminada. Recientemente, diferentes especies de bacillus han sido implicadas en diversos tipos de infecciones y padecimientos.

Posibles usos y aplicaciones en otros campos

En la actualidad, ambientalistas e investigadores buscan estrategias eficientes para rescatar ecosistemas contaminados y protegerlos de daños mayores. Una posible solución es el uso de microorganismos y explotar sus capacidades de degradación de contaminantes en suelos y aguas contaminadas. Se ha demostrado que B. licheniformis tiene efectos positivos en la biorremediación, mejorando el crecimiento del arroz en suelos contaminados con níquel, biofortificación del trigo con selenio, degradación de fenoles en aguas contaminadas, así como su capacidad de eliminar el mercurio en un 70% en condiciones óptimas en suelos contaminados (Wróbel et al., 2023, Harirchi et al., 2022).

Figura 3. Uso de Bacillus spp. en diferentes campos y ejemplos de especies con aplicaciones específicas.

Indudablemente, el género Bacillus ha encontrado aplicaciones en diferentes campos de la industria y Biotecnología; la producción y aplicación de sus enzimas y metabolitos de la bacteria han beneficiado grandemente a la salud humana en la producción de antibióticos, agentes antivirales y antitumorales, péptidos antimicrobianos; en la acuicultura y ganadería como aditivo en alimentos, como probiótico para uso humano y animal, como BPCV en la agricultura y como agente bioremediador para ecosistemas contaminados (Figura 3). En medida en que nuevos estudios contribuyan al entendimiento de la biología de Bacillus más herramientas y aplicaciones se desarrollarán para el uso de este género.

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