El estado vítreo: la vida eterna de las células vegetales

Tema: En este artículo hablaremos sobre la crioconservación de tejidos vegetales; una técnica que permite el almacenamiento a largo plazo de explantes (hojas tallos, raíces, yemas, esporas o semillas) para su conservación y su futura utilización. Aunque la técnica es una alternativa viable al problema de la conservación de especies de interés agronómico a largo plazo, la misma representa un reto, ya que se requieren condiciones y procedimientos muy especiales para mantener el material en estado vítreo y conservarlo en buenas condiciones para poder regenerarlo.  

1. Introducción 

La conservación de los recursos genéticos vegetales es importante para el desarrollo y la mejora del sector agrícola. Los bancos de germoplasma, que son grandes reservorios de años de evolución de las plantas, representan no solo la riqueza de las especies que conserva, sino la capacidad de abastecer de alimento a las generaciones futuras. Conservar los genotipos importantes (importantes para la producción de alimentos, medicamentos, fibras etc.) para la subsistencia del hombre es muy apremiante, por lo que existen estrategias que lo hacen posible, como la crioconservación. Esta tecnología permite conservar el material vegetal durante largos períodos de tiempo, podemos conservar en el laboratorio (in vitro) semillas ortodoxas, recalcitrantes y explantes de especies propagadas vegetativamente (Martínez-Montero et al., 2012).

La seguridad alimentaria, la agricultura sostenible y la preservación de la biodiversidad dependen de la conservación de los recursos genéticos vegetales. La diversidad genética es necesaria para mejorar los cultivos, adaptarlos a los cambios ambientales, conferirles resistencia a plagas y enfermedades.  La pérdida de biodiversidad es una de las problemáticas más importantes a las que se enfrenta el mundo; este problema no solo afecta en la desaparición de especies, si no que genera un impacto negativo sobre la dinámica de otras especies como el aumento de enfermedades y plagas.  Debido a que algunas de las principales causas de la disminución de la biodiversidad incluyen: el cambio climático, la sobreexplotación de recursos naturales, la destrucción de hábitats, y la introducción de especies invasoras, la conservación ex situ (fuera de su hábitat natural) de especies vegetales amenazadas permitirá el rescate de especies de interés y la recuperación del material vegetal (Bellon et al., 2009). Aunque existen muchos métodos de conservación de la biodiversidad, la crioconservación es el único método que ha demostrado efectividad para preservar esta diversidad genética a largo plazo, especialmente para especies vegetales que son difíciles de conservar mediante métodos tradicionales como los bancos de semillas o jardines botánicos (González-Arnao et al., 2013).

2. Crioconservación: ¿cómo prevenir la formación de hielo dentro de la célula?

La crioconservación es un método de conservación a largo plazo que requiere el almacenamiento de células, tejidos, órganos u otros materiales biológicos a temperaturas muy bajas, usualmente se utiliza nitrógeno líquido (LN, por sus siglas en inglés); en este estado, el nitrógeno se encuentra a -196 °C (Fig. 1). Bajo estas condiciones, los procesos y rutas metabólicas detienen su funcionamiento, lo que permite que el material vegetal se conserve durante muchos años sin llegar a sufrir deterioro significativo (Medina y Serrano, 2012).  La crioconservación de material vegetal en nitrógeno líquido ha sido descrita como una tecnología adecuada para conservar los recursos genéticos de varias especies. Sin embargo, los efectos potenciales del LN en el crecimiento posterior de las plantas en el campo deben estudiarse antes de la implementación a gran escala de bancos de crioconservación de germoplasma (Martínez-Montero et al., 2012).

Uno de los principales desafíos de esta técnica es la formación de hielo intracelular, ya que los cristales de hielo pueden dañar tanto las estructuras como los organelos de las células, causando su muerte. Por ello, es necesario que la célula atraviese un proceso de vitrificación o estado vítreo, sin pasar por el punto de congelación (Westendorp y Encinas, 2004).  La crioconservación implica la eliminación del agua libre de los tejidos mediante deshidratación física u osmótica, seguida de una congelación ultrarrápida y mantenerse en el estado vítreo para su conservación por un tiempo teóricamente ilimitado (Benelli, 2021;  Zamecnik et al., 2021).

Figura 1. La criopreservación o crioconservación consiste en la preservación de células y tejidos por acción de temperaturas controladas extremadamente bajas. El “alma” de la crioconservación es, sin duda alguna, el nitrógeno líquido. Panel izquierdo, Tanque de nitrógeno líquido cerrado, Panel derecho, Tanque de nitrógeno líquido abierto se observa el nitrógeno evaporándose (modificada de https://jpmas.com.ni/nicaragua-primera-planta-procesadora-de-nitrogeno-liquido-en-centroamerica/).

2.1 Pero ¿qué es el estado vítreo?

El estado vítreo es un estado de la materia amorfa, con aspecto semisólido y transparente, que se forma al enfriar un líquido rápidamente. A este proceso se le llama vitrificación y consiste en pasar el tejido vegetal de la temperatura ambiente (23°C) a una temperatura de -190°C, de esta manera el tejido se pasa a un estado amorfo, pero sin la formación de cristales de hielo, por lo que las células se mantienen intactas. Para lograrlo es importante el uso de crioprotectores y una rápida reducción de temperatura. Una manera de lograr que un cuerpo entre en estado vítreo es enfriándolo rápidamente para evitar que la cristalización ocurra dentro de las células y cause daño. La materia en estado vítreo contiene átomos inmovilizados, presenta un aspecto sólido con cierta dureza y rigidez y si se le aplica una fuerza tiende a deformarse. En el laboratorio, este estado de los tejidos se puede lograr sumergiendo los explantes en LN, sin embargo, la utilización de sustancias crioprotectoras y vitrificantes juegan un papel importante para lograr que el material biológico que pasa por el estado vítreo pueda volver a un estado normal para la repropagación del explante (Benelli, 2021).

2.1.1 La técnica de crioplaca (crioplate, por sus siglas en inglés)

El método de crioplate consiste en colocar explantes (semillas, yemas, polen, embriones, células etc.) en placas de aluminio con pocillos de aproximadamente 1.5 mm de diámetro y 0.5 mm de profundidad lo que facilita el manejo de fluidos y el tratamiento de secado (Fig. 2 izq). En estas placas de aluminio, los explantes se encapsulan, deshidratan y congelan (Fig. 2 der). Estas crioplacas se pueden comprar o elaborar a partir de láminas de aluminio y se pueden utilizar sin ningún problema (Yamamoto et al., 2011, 2015).

Figura 2. Diseños y carga de crioplacas de aluminio. Panel izquierdo, pocillos de crioplacas. A: ancho 3 mm, profundidad 0.5 mm. B: ancho 1.5 mm, profundidad 0.5. Panel derecho, carga de crioplacas durante el procedimiento de vitrificación.

Material vegetal. Para la selección del material vegetal es importante la selección de plantas de apariencia sana y vigorosa, procedentes de cultivos in vitro, para asegurar que no existen factores que puedan causar contaminación. Es importante el uso de tejidos jóvenes (callos, yemas o células meristemáticas) ya que poseen amplia capacidad de regeneración y diferenciación celular, aunque también se pueden utilizar como explante hojas o tallos. Es importante mencionar que los explantes deben medir de 1 a 2 mm de grosor por lo que la preparación del material (disección) se debe realizar usando un microscopio estereoscópico bajo condiciones de esterilidad (Fig. 3-1 y 3-2).

El pretratamiento del material vegetal. El pretratamiento del material vegetal o preparación del tejido es una de las etapas más importantes de la crioconservación. El tratamiento previo puede incluir cambiar gradualmente la temperatura y/o permitir un exceso de azúcar en el medio para comenzar una deshidratación desde el medio de cultivo.

¿Cómo se encapsulan los explantes? El proceso de encapsulación consiste colocar el explante en una solución de alginato de sodio a una concentración de 12 g/L (el alginato se disuelve en medio de cultivo) y en seguida se colocan los explantes (yemas, protocormos o semillas) en los pocillos de la crioplaca. Finalmente, se le coloca la solución de cloruro de calcio 10 g/L.  Para la técnica de crioplate cada explante se coloca en un orificio de la crioplaca de aluminio y se vierten 5 microlitros de alginato de sodio y 5 microlitros de cloruro de calcio esperando la formación de la gelatina durante 2 minutos (Fig. 3-3). Este procedimiento protege a los tejidos vegetales y reduce la probabilidad de que se formen cristales en las células (Yamamoto et al., 2011).

Figura 3. Pasos que se requieren para la implementación de la técnica de crioplate (elaborada con biorender.com). 

Soluciones crioprotectoras y vitrificantes. Después de encapsular los explantes se procede a someterlos a las soluciones vitrificadoras o crioprotectantes; en este paso se pueden probar diferentes tiempos y concentraciones sobre el explante. Para evitar la cristalización y/o el daño por frío a las células, las soluciones crioprotectoras y vitrificantes se agregan a los tejidos vegetales antes de congelarlos para proteger tanto el interior como el exterior de la célula. El uso de estas soluciones previene la formación de cristales de hielo y reduce el riesgo de daño a las estructuras de los orgánulos celulares al promover una rápida deshidratación celular, modulando el efecto de la alta concentración de soluto en la célula, generando un estado vítreo. Además, estas soluciones previenen una deshidratación letal, permitiendo que las células sobrevivan a temperaturas extremadamente bajas lo que asegura la tasa de regeneración del material vegetal después de la crioconservación (Westendorp y Encinas, 2004).

Los crioprotectores intracelulares o penetrantes.  Son moléculas de bajo peso molecular y permeables como el glicerol, el polietilenglicol, la sacarosa, el dimetilsulfóxido (DMSO) y el propanodiol (PROH) que tienen la capacidad de penetrar en las membranas celulares deshidratando el tejido; son las responsables de generar el estado vítreo dentro de la célula.

Las soluciones crioprotectoras extracelulares o no penetrantes. Son sustancias que no penetran la membrana de la célula y tienen la función de reducir el gradiente hiperosmótico que se forma cuando las células sufren la transición del proceso de congelación. A medida que hay menos agua disponible para funcionar, las concentraciones de sal aumentan drásticamente. Es decir, sirven como balance para la presión osmótica diferencial y para prevenir el flujo de agua desde la célula, como ejemplos de estas moléculas se pueden mencionar la sacarosa, la dextrosa y la polivinilpirrolidona (PVP). 

El material vegetal ya encapsulado en el alginato, que se encuentra dentro de los orificios de la crioplaca, se coloca en esta solución para posteriormente colocar las crioplacas en crioviales de 2 mL que son almacenados en los contenedores de NL (Fig. 3-5 a 7).

3. Recuperación del tejido a partir del estado vítreo

Una vez pasado el tiempo deseado en el NL, es necesario sacar el material del estado vítreo. Para esto es importante llevar el material de-196°C (NL) a 40°C (baño María) y dejarlo durante 10 segundos con la intención de no permitir que pase por el punto de congelación del agua (0°C) donde se puedan generar cristales. Después, los explantes se colocan en una solución de descarga, que es un paso muy importante ya que promueve la rehidratación paulatina del tejido. Finalmente, los explantes se colocan en el cultivo in vitro, para recuperar el tejido; de esta manera se devuelve a la vida una planta y solo se espera su regeneración para usarse en diferentes procesos (Fig. 3-8) (Westendorp y Encinas, 2004). 

4. Avances en la tecnología de crioconservación

La investigación de la crioconservación ha experimentado grandes avances gracias a la integración de ciencias ómicas como la genómica, la proteómica y la metabolómica. La comprensión de los procesos moleculares y fisiológicos involucrados en la crioconservación puede mejorarse mediante el uso de estas técnicas. Por ejemplo, la proteómica y la metabolómica pueden revelar cambios en los perfiles de proteínas y metabolitos durante el almacenamiento, mientras que los estudios genéticos pueden encontrar genes y vías metabólicas asociadas con la resistencia al estrés por frío. Muchas innovaciones han surgido en los últimos años que han aumentado la eficiencia del proceso. Estos avances incluyen la creación de nuevos crioprotectores no tóxicos, y la estandarización de protocolos eficientes. La crioconservación se ha utilizado con éxito para proteger especies de plantas en peligro de extinción, así como especies de interés agrícola, algunas especies de orquídeas poco comunes (Medina-Mendoza et al., 2023), plantas medicinales y árboles (Abdelnour-Esquivel et al., 2007), piña y caña de azúcar (Martínez-Montero, et al, 2012), y uvas de valor agrícola (Esquivel-Figueroa et al., 2023) que han sido objeto de estudios exitosos en la conservación.

A pesar de los avances en la crioconservación, aún existen algunos desafíos que deben abordarse como criterios para la selección de explantes (Fig. 4), reducir la toxicidad de los crioprotectores, definir con mayor precisión los tiempos de inmersión en las soluciones, en general, la estandarización de un protocolo para cada especie y explante en particular.

Figura 4. Ejemplos de materiales vegetales que se pueden crioconservar.  A) aspecto de las semillas de zarzamora, b) hojas de zarzamora en medio de cultivo in vitro, c) tallos que contienen yemas de zarzamora en cultivo in vitro, d) aspecto de callos embriogénicos obtenidos a partir de hojas, e) aspecto de brotes generados a partir de callo embriogénico y f) plántula obtenida en cultivo in vitro.

5. Conclusión

La crioconservación es una técnica muy exitosa en la conservación de tejidos vegetales a largo plazo que ofrece muchas ventajas, aunque hay mucho trabajo para ajustar los protocolos para cada especie. No obstante, esta técnica podría aplicarse a diversas especies de interés agrícola y mantener la biodiversidad necesaria para los programas de mejora genética de plantas.

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